酶联免疫斑点技术(Elispot)技术优势(1)单细胞水平,活细胞功能检测:弥补了体液中CK半衰期短的不足,当体液中某CK含量较低时,用ELISPOT法检测具有较高灵敏性。(2)操作简便经济,可以进行高通量筛选:既可检测自发分泌细胞,又可检测抗原特异性CK分泌细胞,具有较高特异性,并可观察药物治疗反应,且使对CSF中T、B细胞研究成为可能,对神经免疫疾病发病机制研究及临床疗效观察均有重要价值。(3)灵敏度高:在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。灵敏度比传统ELISA方法高2-3个数量级。抗体芯片是将大量不同的抗原特异性结合的抗体有序地排列、固定于固相载体表面,形成微阵列。流式抗体染色
液态流式技术(Luminex)流式荧光,又称悬浮阵列、液相芯片等,是近20多年逐渐发展起来的多指标联合诊断技术。该技术以荧光编码微球为中心,集流式原理、激光分析、高速数字信号处理等多种技术于一体,多指标并行分析,可一管同时准确定量检测2-100种不同的生物分子;具有高通量、高灵敏度、并行检测等特点;可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等多方面、多领域的研究。基本原理:应用微球和流式细胞仪的原理,微球内部含有三种免疫荧光,通过荧光不同的比例可以区分100种不同的微球。每种微球可以用来检测一种不同的蛋白或基因。因此,利用微球技术,可以同时检测高达100个蛋白或基因。Luminex技术的测量结果在准确度、精确度、灵敏度方面与ELISA均可达到相似的水平。Luminex应用的荧光编码微球带有针对不同目标分子的特异性抗体,不同的微球在一定程度上可以自由组合,这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。多目标分子的同时测定可以减少生物样品的消耗量,节省成本和测定时间,并且使多种目标分子之间相关性的分析更加准确。流式抗体染色PCR Array:用于检测生物学功能相关的一系列基因的表达量变化,发现变化比较明显的标志性基因。
Luminex液相悬浮芯片是基于高通量微孔板的多重检测抗体芯片技术。其基本原理是将高度特异的捕获单克隆抗体偶联到不同荧光标记的磁珠上,将不同种类磁珠混合后悬浮于96孔微孔板中。在检测时,一束激光照射磁珠上的荧光,识别磁珠标记的捕获抗体,从而获知该磁珠可检测哪种细胞因子,从而实现“定性”作用。进一步,通过加入生物素标记的高亲和配对检测抗体,同步识别磁珠抓取的目标细胞因子,形成“三明治”结构,并加入SA-PE偶联上生物素,通过另一束激光照射进行信号放大检测,实现“定量”作用。
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LUMINEX常见问题及解答(一)1)LUMINEX应用于哪些领域?生物医学研究,生物标记物开发,临床检测等领域。Luminex技术主要用于蛋白和核酸检测分析。2)LUMINEX敏感性如何?灵敏度取决于开头的质量。对于同样的抗体对,Luminex检测的灵敏度高于ELISA技术。一般检测灵敏度在pg级。3)对不同类型的样品制备和样品量的要求是怎样的?血清、血浆是常用的样本,每次检测需要10ul,每次可以检测多个蛋白。从各种细胞或组织中提取的蛋白也可以用Luminex技术检测,制备方法与ELISA、WesternBlot完全一样。4)一般可以检测到多少基因或蛋白的表达信息?检测蛋白和基因的数目主要取决于试剂盒。蛋白质检测目前可以达到50个左右,基因检测可达500个。5)如何保证检测结果的特异性?检测的特异性取决于抗体高特异性。试剂几乎全部来源于美国大公司,产品经过了严格的质量控制。同时,我们检测公司也有近15年的经验、严格的操作程序和质量控制体系。LabEx多因子检测技术应用。流式抗体染色
细胞因子检测是一个强大的工具,通过定制识别产生积极反应的细胞因子的独特组合。流式抗体染色
Q:多因子实验还用的样本类型有可些?A:Serum(血清)、Plasma(血浆)、Cell/Tissuelysate(细胞/组织裂解液)、CerebrospinalFluid(脑脊液)、BronchoalveolarLavageFluid(支气管肺泡灌洗液)、NasalLavage(鼻腔灌洗液)、FluidPeritonealFluid(腹腔液)等等。Q:多因子实验中血清好检测,还是血浆好检测?A:文献报道EDTA的血浆适合做多因子实验,具体需研究者根据自己实际条件选择。Q:为什么要做预实验?A:试剂说明书中的样本稀释比例不精确,需要进一步确认。预实验主要目的∶1.确定好较好稀释比例,让尽可能多的因子在检测范围内,从而提高检出率。2.避免样本浓度过高,导致结果不准确。3.让研究者在正式实验中有选择的依据。Q:血清血聚溶血,对实验结果有形响吗?A:肯定有影响。溶血是红细胞破裂导致的,轻微溶血都是可以接受,但从溶血的严重程度看区别较大,样本普遍存在些许溶血情况,从目前文献上看没有明确的数据支持。流式抗体染色
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